بررسی اثر سیپروفلوکساسین روی ساختار بافتی و هیستوشیمیایی بیضه کیفیت اسپرم و توانایی باروری در موشهای سوری

چکیده پایان نامه شماره 21-1 دکتری تخصصی دانشگاه ارومیه سال تحصیلی: 1391-1390 نگارنده: فاطمه زبیری عنوان پایان نامه: بررسی اثر سیپروفلوکساسین روی ساختار بافتی و هیستوشیمیایی بیضه، کیفیت اسپرم و توانایی باروری در موشهای سوری امروزه ناباروری مشکل اساسی در %20-15زوجهایی است که در سن تولید مثل قرار دارند. ناباروری جنس مذکر در نیمی از زوجهایی که به کلینیکهای ناباروری مراجعه می کنند دیده می شود. عوامل مختلفی درناباروری جنس مذکر تأثیرگذار است و از میان این عوامل فاکتورهای محیطی مانند داروها و مواد شیمیایی از مهمترین فاکتورها می باشند. سیپروفلوکساسین، متعلق به نسل دوم فلوروکینولونها است که به صورت معمول در درمان بسیاری از عفونتهای میکروبی مانند عفونتهای استخوان و مفاصل، عفونتهای دستگاه تنفسی و ادراری مورد استفاده قرار می گیرد. اساس فعالیت این دارو از طریق مهار توپوایزومراز ii /dnagyrase باکتریها می باشد. هدف از انجام این مطالعه، بررسی اثرات سیپروفلوکساسین بر روی کارآیی سیستم تناسلی نر از طریق ارزیابی پتانسیل باروری، ظرفیت آنتی اکسیدانتی بافت بیضه، فعالیت کاسپاز-3 و کاسپاز-9 در بافت بیضه، غلظت سرمی تستوسترون، پارامترهای اسپرم، یکپارچگی dna و کیفیت کروماتین اسپرم در موش سوری می باشد. همچنین تغییرات هیستوپاتولوژیکی و هیستوشیمیایی بافت بیضه در این تحقیق بررسی گشت. در نهایت نقش مسیر میتوکندریایی در آپوپتوز ایجاد شده توسط سیپروفلوکساسین در سلولهای اسپرم کشت داده شده مورد ارزیابی قرار گرفت. در این بررسی از 24 سر موش سوری نر نژاد nmri استفاده گردید. سیپروفلوکساسین حل شده در کربوکسی متیل سلولز در دوزهای mg/kg 412 و 206 به مدت 45 روز از طریق گاواژ تجویز گردید و گروه کنترل به طور همزمان کربوکسی متیل سلولز را دریافت نمودند. در انتهای دوره درمانی حیوانات آسان کشی شدند و بیضه و دم اپیدیدیم از بافت احشایی جدا شد. یکی از بیضه ها جهت فیکس شدن برای تهیه مقاطع میکروسکوپی در داخل فرمالین بافری 10 درصد قرار داده شد و بیضه دیگر جهت انجام کارهای هیستوشیمی وآزمایشات بیوشیمیایی تا زمان انجام آزمایش در دمای 70- درجه سانتی گراد نگهداری شد. اسپرم های آزاد شده از دم اپیدیدیم جهت ارزیابی کیفیت اسپرم، کیفیت کروماتین و آسیب dna آنالیز شدند. همچنین میزان باروری آزمایشگاهی، جنین های دو سلولی، بلاستوسیست و جنین های متوقف شده مورد بررسی قرار گرفت. ظرفیت آنتی اکسیدانتی بافت بیضه بوسیله اندازه گیری توانایی آنتی اکسیدانتها در تبدیل 3+fe به2+ feبا استفاده از آزمایش کاهش قدرت احیاءکنندگی فریک یا frap ارزیابی شد. فعالیت آنزیم کاسپاز-3 و -9 در بافت بیضه با روش الایزای ساندویچی با استفاده از کیت اختصاصی کاسپاز-3 و -9 موش سوری اندازه گیری شد. پس از استخراج dna از نمونه های بافتی بیضه، مرگ سلولی آپوپتوتیک از طریق آنالیز ژل الکتروفورز با عکس برداری توسط تابش اشعه x مورد بررسی قرار گرفت. سیتوتوکسیسیتی سیپروفلوکساسین، پتانسیل غشاء میتوکندریایی و میزان کاسپاز-3 و -9 در سلولهای اسپرم کشت داده شده به ترتیب از طریق تست mtt و ارزیابی های مربوط به jc-1 aggregation ، کاسپاز-3 و -9 مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که میزان فعالیت کاسپاز-3 و -9 در بافت بیضه گروههای درمان شده با دوز پایین و دوز بالای سیپروفلوکساسین در مقایسه با گروه کنترل افزایش یافته است. همچنین بررسی ژل محتوی باندها با عکس برداری توسط اشعه x نشان داد که در گروه درمان شده با سیپروفلوکساسین در الکتروفوروگرام ژل آگارز الگوی ویژه نردبانی تشکیل شده است. در این بررسی علیرغم اینکه ظرفیت آنتی اکسیدانتی بافت بیضه در دو دوز پایین و بالا به شکل ملایمی افزایش پیدا کرده ولی از لحاظ آماری افزایش مذکور معنی دار نیست. همچنین نتایج نشان داد که سیپروفلوکساسین باعث کاهش معنی دار تعداد اسپرم های اپی دیدیمی و کاهش تحرک آنها می گردد. در حالی که تعداد اسپرم های مرده و غیر طبیعی و نیز اسپرم های بلوغ نیافته (اسپرم هایی با اختلال در پروتامینیشن) و اسپرم های با dna آسیب دیده به صورت معنی داری افزایش یافت. متعاقب تجویز سیپروفلوکساسین کاهش معنی داری در غلظت سرمی تستوسترون به همراه اختلال در اسپرماتوژنز و کاهش پتانسیل باروری مشاهده گردید. در گروههای درمان شده با سیپروفلوکساسین، میزان کربوهیدرات داخل سیتوپلاسمی در رده اسپرماتوژنز کاهش پیدا کرد و همزمان ذخایر چربی و سطح آنزیم آلکالین فسفاتاز بویژه در اپی تلیوم زایگر دژنره افزایش یافت. سیپروفلوکساسین بر روی سلولهای اسپرم کشت داده شده سیتوتوکسیسیتی معنی داری در یک روند وابسته به دوز ایجاد کرد.ec50 در این تست 73/146 میکروگرم به ازای میلی لیتر تعیین گردید.کاهش پتانسیل غشاء میتوکندریایی در سلولهای اسپرم درمان شده با دوزهای مساوی و بالاتر از 50 میکروگرم به ازای میلی لیتر پس از 36 ساعت در مقایسه با سلولهای گروه کنترل معنی دار بود. افزایش فعالیت کاسپاز-3 و -9 در سلولهای درمان شده با دوز مساوی و بالاتر از 50 میکروگرم به ازای میلی لیتر به ترتیب در مدت 36 و 24 ساعت در مقایسه با گروه کنترل معنی دار بود. نتایج مطالعه حاضر بیانگر اثرات توکسیک سیپروفلوکساسین بر روی کارآیی تولید مثلی موش سوری نر می باشد. تغییرات مربوط به رادیکالهای آزاد (که به نوبه خود باعث استرس اکسیداتیو می شود) در مدت 45 روز چندان قابل توجه نبوده لذا ظرفیت آنتی اکسیدانتی سرم تغییر چندانی را نشان نمی دهد. بنابراین آسیب های وارده به بافت بیضه و سلولهای ژرمینال می تواند به آپوپتوز سلولهای ژرمینال (تأثیر مستقیم دارو) و یا تغییرات مربوط به کاهش دسترسی سلولها به منابع انرژی از قبیل گلوکز مربوط باشد. همچنین بررسی حاضر مبتنی بر شواهد جدیدی از توانایی سیپروفلوکساسین بر روی القاء آپوپتوز در سلولهای اسپرم در یک روند وابسته به دوز و زمان است که از طریق فعال شدن مسیر داخلی آپوپتوز به واسطه میتوکندری انجام می گیرد. اثرات سیپروفلوکساسین در القاء آپوپتوز مرتبط با بیان ژنی در اسپرم نیاز به تحقیقات بیشتری دارد.